TOPO-TA Blunt Simple Lightning Cloning Kit

TOPO-TA/Blunt Simple Lightning Cloning Kit-

目录号：42212

产品内容：

保存条件：

-20℃，存放12个月，不影响使用效果。

产品简介：

可在室温条件下，20分钟完成TA克隆或Blunt克隆，阳性率接近100%，并且免冰浴、免热激、免蓝白斑筛选，还可以连接长达10kb的DNA片段。

克隆步骤（≤3kb 片段）：简化步骤（≤10kb片段）免复苏，免液体LB

1、连接：室温5分钟；1、连接:37℃连接5min。

2、转化：室温5分钟；2、转化：冰浴5min，42℃热激1min，冰上2min。

3、复苏：180rpm、37℃振荡培养10分钟；涂板。3、取全部菌液涂板，37℃倒置培养。

操作步骤：

1.PCR产物的制备：

a.引物要求：引物不能磷酸化。

b.酶的选择：根据需要选择DNA聚合酶，该载体兼容PCR产物的A末端和平末端。

c.电泳检测PCR 产物的量和质量：

①仅有目的条带，可直接进行连接反应，无需纯化；

②如果有多条带，建议凝胶回收 DNA 片段（DC011-100）;

③如果以质粒为模板的扩增，则必须进行凝胶回收，因为模板质粒也会长出非目的菌落。

2.连接反应：

1）室温（20℃-37℃）建立连接体系（10ul体系）：

不同大小插入片段的推荐用量：

加完试剂后，轻弹管底混匀（或轻轻吹打混匀），点甩离心收集所有液体在离心管底。

2)室温（20℃-37℃）连接5分钟。连接产物可直接转化感受态细胞，或置于冰上备用。

3.转化、复苏、涂板：

1）100ul感受态细胞，置于室温解冻（约1分钟左右），轻掸几次将细胞均匀悬浮。

2）加入10ul 连接液，轻轻混匀，室温（20℃-37℃）放置5 分钟。

3）加入500ul平衡至室温的LB或者SOC培养基(不含抗生素)，37℃180rpm振荡培养10min。

（注意：大于3kb的片段，振荡培养时间延长至 30-60分钟，可以增加转化子。或者用简化步骤）

4）取200l菌液涂板(含氨苄青霉su50-100ug/ml），培养过夜。（为得到较多克隆，4000rpm离心1 min，吸弃掉部分上清，保留100-150ul，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板）

注意：如果使用5ul体系，各成分按照比例减半，使用次数可以加倍。

4.转化子的筛选鉴定：

本制品阳性率相当高，一般情况下，可以达到所见即所得，只要是长出来的菌落正常（不是污染的杂菌，转化子数量也不算太少），基本就包含插入。因此插入片段不超过2-3kb的情况下可以不用鉴定直接挑1-2 个菌去测序。

1）菌落PCR检测：挑单菌落于 10ul无菌水中，混匀，取 1ul置于25ulPCR体系,用PCR 引物或者M13 通用引物去鉴定阳性克隆。

2）用通用 M13F（-20）/M13R（-26）引物测序来确定是否含有目的克隆。

TOPO-TA/Blunt Simple Lightning Cloning Kit-